La Cattedrale è situata entro un terrazzamento romano delimitato, sul lato settentrionale, da un muro di contenimento, ancora oggi visibile all’interno della chiesa e della Cripta; gli archeologi identificano questo sito con il Foro del municipio romano di Asisium.
Nel 412, secondo la tradizione, vi fu costruita una piccola chiesa per ospitare il corpo di san Rufino, primo vescovo di Assisi e patrono della città, martirizzato nel 238 nel fiume Chiascio. Nel 1029, il vescovo Ugone fece costruire una seconda chiesa, nel luogo della precedente, e nel 1036 le diede il titolo di Cattedrale. Di questa chiesa, che occupava gran parte del sagrato, rimane solo la Cripta, sottoposta alla facciata della chiesa attuale, e il campanile romanico. Nel 1134 furono decisi l’abbattimento dell’edificio ugoniano e la costruzione di una nuova chiesa, alle spalle della precedente. La nuova Cattedrale venne eretta nel 1140 dall’architetto Giovanni da Gubbio, come ricorda una lapide murata all’esterno dell’abside. I lavori precedettero lentamente e non erano ancora terminati nel 1210, quando un patto di pacificazione tra i Maiores ed i Minores della città stabiliva la prosecuzione dei lavori. L’altare fu consacrato da papa Gregorio IX nel 1228; nel 1253 Innocenzo IV consacrò la chiesa ormai ultimata.
L’interno ha perduto l’originale aspetto romanico, che presentava tre navate divise da pilastri e presbiterio soprelevato, in seguito ad un totale rifacimento progettato nel 1571 dall’architetto Galeazzo Alessi. Sopra le volte (non visitabili) si possono ancora vedere alcune strutture della chiesa del XII secolo, tra cui i resti di una cupola. Il restauro dell’Alessi, motivato da dissesti statici, ha donato all’interno un tipico impianto tardo-rinascimentale, grazie all’innesto di un corpo a pianta longitudinale su uno a pianta ottagonale: l’effetto doveva essere ancora più sensibile prima del 1848, quando furono aperti i varchi infondo alle navate laterali e distrutti gli altari sotto la cupola.